Hipertônica fluidoterapia na Fibrose …

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Abstrato

PROCEDIMENTOS Experimentais

tiróide de rato Fisher (FRT) Células epiteliais transfectadas de forma stable com o plasmídeo de Controlo (that codifica uma proteína fluorescente amarela) UO com plasmídeos that codificam AQP1, AQP3, or AQP4 (14) cultivadas were em Meio F-12 / Coombs ( Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de Soro fetal de bovino (Hyclone), penicilina G (100 unidades / ml), estreptomicina (100 ug / ml), e Os Marcadores de Selecção antibiotica apropriada. Pará como Experiências de diluição de corante, como Células were plaqueadas em FRT inserções Transwell NÃO revestidas e utilizadas parágrafo medições de Fluxo de resistências de 2-5 k Ω · cm 2.

Para Calcular membrana plasmática Pf . Relativa fluorescência (F (t ) /Fo ) Were ajustados uma exponencial Única Uma Função (Como acima) Pará Estudos de Células DRF OU Uma Função bi-exponencial (F (t ) /Fo = UMA ·et / Τ1 + B ·et / Τ2 + C ) Para Estudos HBE. Membrana de plasma Pf foi calculada Como descrito Acima, Onde uma área de superficie S foi Tomada Como uma área de superficie apical da monocamada de Células, assumindo Uma superficie plana, lisa. A altura da Camada de Células Variável sem tempo, h (t ), Foi relacionada com uma amplitude Normalizados de according com A Queda definitiva de 50% do previsto a Partir da altura inicial (ho ) Em condições hipertônica. Para FRT e Células HBE, ho foi Feita Como 5 e 20 uM, respectively. Pf em SEGUIDA, calculada foi a Partir dh (0) / dt = Pf v ·W · (Φ1 – Φ2 ).

Em Tempo baseada reais em fluorescência de RT-PCR foi realizada parágrafo comparar AQP3 Relativa, AQP4, e uma expression fazer mRNA AQP5 em Não-CF versus Células CF utilizando o LightCycler ™ e com o LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I kit (Roche Diagnostics) de according com como INSTRUÇÕES do Fabricante. Superficie de Células epiteliais were dissociadas A Partir de brônquios Humanos, Ultracongelados e armazenados a -80 ° C Até Ser descongelada parágrafo Isolamento de ARN. Os iniciadores de PCR were Como descrito Acima. Os Resultados were apresentados Como Uma Relação normalizada, calibrado com Todas como Amostras normalizadas parágrafo a p-actina. como proporções de Concentração parágrafo Cada Amostra CF e Não-CF were CALIBRADOS parágrafo Amostras de calibrador (agrupada cDNA A Partir de individuos Não-CF), com OS Resultados apresentados Como Uma Razão normalizada com um sample de calibrador Como o denominador Como se segue: Nível de ARNm Relativa = Relação de Amostra (target / Referência) / proporção de calibrador (target / Referência).

RESULTADOS

Transporte de Água no epitélio das vias Aéreas superficie foi ESTUDADA utilizando Culturas de Células HBE Bem diferenciados. Transepitelial permeabilidade agente penetrante de Água foi medido utilizando hum Método de diluição com corante that ENSAIA o Fluxo de Água atraves do epitélio Apertado cultivadas em Filtros porosos (fig. 2UMA ). A fluorescência de hum marcador de volume de Solução de apical fornecida Uma Leitura quantitativa de transporte de Água osmoticamente atraves da Camada de Células. Um gradiente osmótico induzido causado o Movimento da Água transepitelial a Partir do Qual a permeabilidade à Água agente penetrante (Pf ) Foi deduzida. Como Culturas Não-CF P0 caracterizados were em Primeiro Lugar. FIG. 2B (topo ) Mostra uma diluição da fluorescência a 37 ° C, em Que hum 300 gradiente de m m d manitol induzida Fluxo osmótico de agua para Dentro da Solução apical, Que Contém o corante. Os Dados na ausencia versus Presença de um amilorida (500 ^ M) were comparados. FIG. 2C currículo transepithelial Pf Valores. De: Não houve Diferença significativa em Pf Apos Exposição de Culturas P0 HBE uma dose Elevada de amilorida (Controle versus amiloride, 54 ± 5 versus 52 ± 19:00 / s). Baixas concentrações de amilorida (100 e 250 μ m) tambem nao se alterou Pf (Não mostrado).

Expressão AQP foi caracterizado POR Células P0 HBE. Hematoxilina e parafina transversais manchados de eosina confirmou a diferenciação das Culturas de 2 Semanas de Idade em hum 4 ~ 20 microns epitélio pseudo-grossa com numerosos cílios (Fig.UMA ). Como Culturas were raspadas Pará uma Análise de RT-PCR, O Que detectado ARNm parágrafo Varias AQPs (Fig 4.B ). Transcrições de AQP3, AQP4 e AQP5 were encontradas em abundancia Maior, consistente com Estudos Anteriores (ver “Discussão”). foi detectada Expressão menor, mas diferente de zero, de AQP1, AQP6 e mRNA AQP7. Quantitativa em Tempo Real de RT-PCR foi realizada parágrafo comparar a Expressão dos principais AQPs EM Culturas P0 HBE de Não-CF versus CF Vias Aéreas. Conforme resumido na Fig. 4C . Não foram encontradas Diferenças significativas na Expressão Transcrição AQP em Não-CF versus Células de FQ. Imunofluorescência Feita em secções de parafina de Culturas HBE e brônquios Humanos intactos demonstrou Expressão AQP3 e proteína AQP4 NAS Membranas basolaterais, Ao Passo Que a Expressão da proteína AQP5 NÃO foi detectada. Coloração Controlo positivo de rim parágrafo AQP3 e AQP4 E mostrado e da glândula salivar parágrafo AQP5.

A Seguir, investigou OS Efeitos Possíveis da amilorida Sobre os principais AQPs pulmonares, incluíndo AQP1 (Expressa em endotélio microvascular), usando Células epiteliais AQP-transfectadas e pulmão do rato intacto. Transepitelial e de membrana de plasma permeabilidades de Água were medidos em Células expressando Quer FRT proteína fluorescente amarela (Controlo), AQP1, AQP3, OU AQP4. permeabilidade transepitelial de Água de Linhas de Células cultivadas em FRT Transwell Suportes Medida APOS FOI como Culturas Formado electricamente monocamadas apertadas. permeabilidades de Água AQP Células Que expressam DRF were MAIORES fazer that em Células de Controlo e NÃO sensível a amilorida (Fig. 5UMA, topo ). FIG. 5UMA (inferior ) Transepithelial Resume Pf Valores. Permeabilidade à Água da membrana do plasma foi Medida NAS Células DRF, com curvas de calceína fluorescentes that equipam funcoes exponenciais simples (Vestígios representativas parágrafo FRT-AQP3 e Células Results Display Resultados FRT-AQP4 NA Fig. 5B, topo ). De according com como medições de permeabilidade transepitelial de Água, plasmática membrana Pf foi Aumentada com a Expressão AQP e NÃO sensível a amilorida (Fig. 5B, inferior ).

DISCUSSÃO

O Objetivo principais Deste Estudo foi Investigar hum Mecanismo Dependente de AQP propostos parágrafo explicar OS Efeitos Clínicos de Solução salina hipertônica nebulizada (HS) e amiloride na Função Pulmonar em CF. A Validade do Mecanismo proposto de Benefício clínico envolvendo AQPs vias Aéreas sensíveis Ao amiloride TEM implicações IMPORTANTES Sobre o Uso de HS versus Os Agentes Não-hiperosmolar de sal em terapia CF, Bem Como na utilização Proposta de Inibidores ENaC fazer tipo amilorida na Prevenção da desidratação do ASL.

permeabilidade à Água do Espaço aéreo-capilar na perfusão pulmonar mouse.UMA. Traços representativos de fluoresceína superficie de fluorescência isotiocianato-dextrano pleural de tipo Selvagem fazer pulmão do rato sem (superior, Esquerda ) E com (Canto direito superior, ) 500 u m amiloride e de pulmão de Nao tratada de rato AQP5-null (inferior ). osmolalidade pulmonar perfusato indicada E arterial. B. resumo das taxas de capilar de Espaço aéreo de Equilíbrio osmótico de Experiências, Conforme descrito PARA O UMA. (Quatro Ratinhos / Condição ± S.E.). Diferença NÃO foi significativa.

Estudos de imunolocalização Anteriores relataram uma Expressão de AQP4 na superficie membrana basolateral em Células epiteliais Ao Longo de Grandes e Pequenas vias Aéreas em Ratinhos, ratos e Seres Humanos (Revisto EM Ref. 30). AQP3 foi Encontrado Para ter um Padrão de Expressão Mais limitada em Membranas de nas Células basolateral basais de Grandes e Centrais vias Aéreas e nasopharnyx. Vários Estudos Tem demonstrado uma Expressão da AQP1 sem endotélio microvascular atraves das vias respiratórias / pulmão, mas NÃO em Células epiteliais (31. 32). AQP5 E expresso Fortemente nenhum tipo I alveolar Células epiteliais em Humanos e roedores e provavelmente em algumas Células epiteliais das vias Aéreas em Grandes vias respiratórias humanas (32. 33). Em Culturas Primárias Bem diferenciados de Células epiteliais das vias respiratórias humanas e em brônquios FIXA humana, encontramos here uma Expressão de AQP3 e AQP4 NAS Membranas basolateral do epitélio das Vias Aéreas, mas NÃO detectaram uma Expressão da proteína AQP5. No entanto, a falta de AQP5 imunocoloração provavelmente reflecte uma falta de especificidade do anticorpo, em vez fazer that a ausencia de proteína funcional, devido à Presença de AQP5 demonstrada em Células epiteliais nasais e bronquiais em Estudos Anteriores (33).

Estudos Funcionais Anteriores sugeriram o Envolvimento de AQPs da permeabilidade à Água das vias Aéreas. medições Nossas Iniciais em microperfused Pequenas vias Aéreas de cobaias mostraram Alta transepitelial permeabilidade à água (Pf ~ 50 mm / s) era that fracamente sensível a temperatura e era Mercúrio-insensível, sugerindo o Envolvimento de AQP4 (7). Dados Recentes de explantes esferóides de pólipos nasais Humanos forneceram Evidências Para uma Função AQP5 sem epitélio das Vias Aéreas. Nestes Grandes, monocamadas de Células das vias Aéreas esféricas, com uma membrana apical ciliada voltado parágrafo fóruns, Pederson et ai. (9) relataram Alta membrana Pf (~ 150 mm / s), era that sensível a Uma breve Exposição uma Mercurio de baixa Concentração. Aqui, Nossa Alta Pf Valores OS Pará como Culturas HBE e uma Dependência da temperatura da permeabilidade fraca sugerem Movimento da Água AQP-mediada (Fig. 2). Disso Além, uma reduzida permeabilidade transepitelial de Água osmótico um pH Baixo na basal (mas NÃO apical) Solução de Frente para a membrana fornece Evidência indirecta parágrafo a Função de AQP3 (a unica via aerea Regulada POR pH AQP) NAS Membranas basolaterais HBE (19 ). A adição de HgCl2 Pará como Culturas utilizadas here resultou em leakiness Marcada com reduzida Resistência transepitelial, impedindo CONCLUSÕES Sobre HgCl2 Efeitos. Culturas CF tinha uma permeabilidade à Água semelhantes Às Culturas Não-CF, consistente com OS NOSSOS Dados de RT-PCR (Fig. 3C Relatórios) E COM OS Anteriores (8. 9).

AGRADECIMENTOS

Agradecêmos Lorna Zlock e Jean Davidson Pará um PREPARACAO de Culturas de epitélio das vias respiratórias humanas, Dr. Michael Matthay de Assistência na Aquisição de Amostras de pulmão, Dr. Dan Zhao parágrafo Obter Ajuda com a Análise de RT-PCR, Dr. Yaunlin Canção Para Aconselhamento técnico Sobre pulmão do rato perfusão e Liman Qian parágrafo Reprodução do rato e Análise do genotipo.

Notas de rodapé

↵ 3 Como abreviaturas utilizadas São: CF, cística fibrose; CFTR, CF regulador de condutância transmembrana; ASL, Líquido da superficie das vias Aéreas; AQP, aquaporin; FRT, Fisher rato tireóide; RT, uma Transcrição reversa; PBS, Solução salina tamponada com fosfato; HBE, epiteliais brônquicas humanas; MES, Ácido 4-morpholineethanesulfonic; HS, hipertônica salina; ENaC, canal de sodio epitelial.

  • Recebeu 05 de maio de 2006.
  • Revisão recebeu 05 de julho de 2006.
  • A Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular, Inc.

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